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本试剂盒可用于从血液中分离完整而纯化的线粒体DNA。线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

组分	50T	100T
DNase I	12mg	2×12mg
RNase A	500μL	2×500μL
红细胞裂解液(10X)	100mL	2×100mL
细胞裂解液	50mL	100mL
线粒体清洗液	25mL	50mL
DNA酶反应液	6mL	12mL
线粒体裂解液	10mL	20mL
蛋白沉淀液	7.5mL	15mL
核酸助沉剂	0.5mL	1mL
TE缓冲液	25mL	50mL

保存：2～8℃，其中DNase I和RNase A需置于-20℃保存，有效期一年

• 使用前，在DNase I中加入600μL的DNA酶反应液，溶解分装后-20℃保存三个月，溶解后的DNASE I如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNase I。
  
• 线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。
  
• 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示
  
  • 全程低温操作；
    
  • 快速；
    
  • 如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
• 线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
  
• 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
  一般低温离心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
  G为离心力，一般以g(重力加速度)的倍数来表示；
  [rpm]²即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。

• 在12mg DNase I中加入600μL的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。
  
• 红细胞裂解液（10X）用双蒸水稀释10倍成工作液（如标本为有核红细胞血液，此试剂用不上，需自备生理盐水或者PBS）。
  
• 线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解。
  
• 离心机温度下降到4℃（2～8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将所有离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量会有一定影响。

• 血液处理：
  血液要求：非肝素钠抗凝血，最好使用新鲜血液。对于陈旧血液，由于冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤，所以线粒体DNA得率会大大减少。
  
  • 对于无核红细胞全血（如哺乳动物处周血），取血约3～5mL（适当分成几管），加入3倍体积的红细胞裂解液（稀释后的工作液，下同），混匀，800×g 5min离心收集白细胞。加入1～2mL红细胞裂解液（稀释后的工作液），吹打重悬白细胞，合并于一管中，800×g 5～10min离心收集白细胞。此时如果白细胞有可见红色，可再次用少量(0.5mL)红细胞裂解液洗细一次。
    
  • 对于有核红细胞全血（如禽类全血），取约300～500μL全血，800×g 5～10min离心收集全细胞，用生理盐水或者PBS清洗两次，留沉淀去上清。清洗时请用去尖吸头吹打。
• 在收集到的细胞中，加入1.0mL冰预冷的细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨20～40次。
  
• 匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g离心5min。
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g再次离心5min（一共两次离心，完整去核）。
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。
  
• 在线粒体沉淀中加入0.5mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min。
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。
  
• 加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μL DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μL TE重悬线粒体沉淀，4℃，12000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。
  
• 得到的沉淀，用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1～2min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
  
• 取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5～10μL核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，12000×g离心10min。
  
• 弃上清，再加入1mL 70%乙醇清洗，4℃，12000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
  
• 弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5～10min。
  
• 加入10～20μL TE缓冲液，轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
  
• 进行DNA检测及-20℃保存，进行下步的实验。

以上方法可以比较完整的去掉核DNA（达到PCR无法检测的级别）但过程复杂，线粒体DNA丢失较多，以下为简单方法，也可以比较好的提到线粒体DNA，在裂解时间合适的情况下，也能去核DNA（达到电泳检测不到的级别）。

• 血液常规处理（红细胞裂解或者全血清洗）
  
• 200μL TE缓冲液重悬全细胞，加入10μL RNase A，加入200μL线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置2～3min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12000×g离心5min。
  
• 取上清，接上面第10步，氯仿抽提，乙醇沉淀。

相关搜索：血液线粒体DNA提取试剂盒，Blood Mitochondrial DNA Extraction Kit